生物药是指从生物体中提取或由生物体产生的具有活性的治疗性生物大分子产品。这些产品包括抗体，重组蛋白，多肽及其衍生物等。生物药在癌症、免疫相关疾病和传染病等多种疾病的治疗和预防方面有显著疗效，推动了近年来国内外生物药研发的热潮。但生物药在人体内有可能通过体液免疫（humoral immunity）或细胞免疫（cellular immunity）引起不良的免疫反应（免疫原性），从而影响药物的安全性和有效性，给药物研发机构（药企和CRO等）和政府监管部门都带来极大的挑战。2014年起，美国，欧盟和中国的药监部门相继推出了多个药物免疫原性研究的指导原则[1,2,3,4]，但在具体执行上还是有一些不太清楚的地方。生物药什么时候在哪些病人身上引起多强的免疫反应有很大的不确定性，目前为止还无法精准预测，因此免疫原性研究事实上是一种风险评估。
安渡生物结合相关的指导原则和对免疫原性研究的经验在此对免疫原性的风险预测、风险识别、风险管控以及评估报告的撰写申报等方面作个简要的介绍。
免疫原性风险预测
生物药进入人体后有可能没有明显的不良免疫反应，也有可能会引起输液反应（infusion-related reaction），激活细胞免疫导致过敏反应或细胞因子释放综合症，或者通过体液免疫产生抗药抗体（ADA）。ADA会和药物结合改变药物动力学（PK）影响药物暴露量。中和型抗药抗体（NAb）会抑制药物的生物活性并进一步降低药物的疗效或引起人体的不良反应。特别是当NAb不仅中和了药物分子本身，同时也与内源性非冗余蛋白质产生交叉反应并中和其生物活性时，会产生更严重的不良反应[5]。例如，在健康志愿者中给予PEG化的MGDF后，产生的NAb与内源血小板生成素交叉反应后会引发严重的血小板减少症[6]；给予促红细胞生成素（EPO）后，产生的NAb会导致单纯红细胞再生障碍(PRCA) [7]。因此在筛选候选药物准备进入临床前研究时，就要开始评估该候选药物产生免疫原性的风险。免疫原性的产生既和药物本身有关（例如药物是鼠源或人源，分子结构及修饰、形成聚合物、混有杂质等），也和病人本身或治疗方案有关（病人的免疫状态，过敏史，遗传背景；给药途径、剂量和频率等）。针对有可能引起免疫原性的因素，通过计算机模拟分析（in silico）、体外实验（in vitro）、动物／体内实验（in vivo），或与同类靶点产品的对比，可以找到一些参考线索，但目前还没有任何一种方法可以准确预测某种药物在人体内是否会引起有害的免疫反应。
生物药作为抗原与抗原呈递细胞（APC）结合后有可能诱导T细胞和B细胞产生一系列的连锁反应产生ADA，就如同氧气、热源和可燃物相互作用会产生火焰一样（图1）。与之类似的，也可以像扑灭火焰一样，从APC, T 或B 细胞三者中的任何一方面作为切入点来降低免疫原性发生的风险[8]。
图1 诱导ADA产生的免疫级联反应示意图[8]
针对生物药本身，可在分子设计阶段通过一系列的“去免疫”方法来降低免疫原性风险。例如抗体的PEG修饰、人源化或者全人源单克隆抗体等传统方法；以及敲除突变容易形成聚集的氨基酸序列、增强二元替换（ABS）等一些新的方法[9]。
APC细胞通过胞吞作用吸收抗原（此处为生物药）并将关键性肽段呈递到细胞表面，供T细胞进行识别并激活。因此，从候选生物药中提前识别出特征肽段（T细胞表位）将有助于控制免疫原性的风险。计算机模拟的方法已经被用于T细胞表位的预测[10]。计算机模拟不需要进行真实的试验且具有很高的筛选通量，对于识别T细胞表位有一定优势，但其它可能引起免疫原性的因素，例如表位-MHC复合体的亲和力、表位的生物学功能等，是不能通过计算机模拟算出的，所以还是需要以体外试验等方法来进一步确认。相较于T细胞表位的预测和识别，有关B细胞表位的预测和识别技术文献报导还比较少，初始B细胞的体外培养半衰期较短，难以在体外对B细胞免疫反应进行有效评估。
作为重要的APC细胞之一的树突状细胞（DC）可以特异性的激活初始T细胞，进而促进B细胞群的成熟和转换，最终导致ADA的产生。因此，了解清楚生物药对于DC细胞的激活能力，可以用来进行免疫原性风险预测。通常做法是用血单核细胞诱导的DC细胞来进行分析，例如与其它的诱导物（如脂多糖LPS）共孵育来诱导并检测DC细胞的成熟，然后利用流式细胞仪检测细胞表面的反应细胞状态的标志物，或者在RNA或蛋白水平分析细胞因子的释放等等。
在生物药的非临床药代动力学实验和毒理实验中也会检测针对生物药的免疫原性。但是，动物模型只能反映免疫原性产生的部分因素，无法涵盖在临床患者中的绝大部分因素，例如人类T细胞的HLA限制性、潜在疾病、遗传背景、免疫史、免疫治疗史等，因此动物模型的免疫原性数据，不能用于预测临床试验中针对生物药的ADA的发生率。但可用于诠释动物体内药代动力学的数据和毒理实验的结果。
总之，我们可以通过计算机模拟分析、体外实验和动物实验，或与同类靶点产品进行对比，做有限的预测，但目前还没有任何一种方法可以准确预测某种药物在人体内引起的不良免疫反应。尽管如此，我们还是可以根据生物药的类型大致推断产生免疫原性的风险。一般来讲，人源化或人源的单抗药物风险相对较低，双抗等引入了新抗原的多结构域，引起免疫原性的风险相对较高，而含有内源性片段的融合蛋白或蛋白酶为高风险药物。
免疫原性风险识别
这里的风险识别主要是指药物的免疫原性特别是针对药物ADA的检测。药物产生免疫原性的风险程度不同，相应的检测策略和临床研究方案的设计也会不一样。目前最常用的是基于ECL平台的桥联法检测到不同标记（Biotin和Sulfo-Tag）的药物通过ADA（IgG或IgM）的多个臂形成的复合体。检测方法需要经过验证后才能用于临床样本或毒理实验样本的检测。最关键的方法开发验证的两个指标是检测方法的灵敏度和药物耐受性。临床样本检测方法的灵敏度一般要求是至少能检测到100 ng/mL的阳性对照（ADA替代品）。非临床样本检测的灵敏度可以放宽到250-500 ng/mL。血清或血浆中的药物会对检测有干扰，所以检测方法的药物耐受性最好高于药谷浓度，即在谷浓度药物存在的情况下还能检测到特定浓度（例如100 ng/mL）的ADA。事实上，这些关键指标用基于液相ELISA平台的检测方法也可以达到。需要说明的是，ADA检测的方法参数表现（如灵敏度、耐药性等）往往取决于所选择的阳性对照抗体和检测方法的设计，因此在解读ADA的数据时需要考虑ADA检测的局限性。检测策略上通常采用多层级分析方法，即通过筛选试验找出推定的ADA阳性样本，然后通过确证试验确认是药物特异性的ADA (图2)。接下来还可以进一步检测ADA的滴度等。对多结构域药物，常常需要检测其ADA的结构域特异性。临床研究的后期（II期或III期）样本一般要求检测ADA的中和特性，但对于高风险药物就有可能要求检测早期（I期）临床研究样本中的NAb。
图2 免疫原性评估策略示意图[2]
ADA检测方法开发验证前要选好阴性对照并提前制备阳性对照抗体。一般选用未给予药物的受试者空白基质作为阴性对照，单个个体的空白基质可用于临界值的确定，而混合多个个体的空白基质可用来配置稀释液或作为每个检测板上的阴性对照。作为ADA替代品的阳性对照抗体可以是药物特异性的单克隆抗体或单抗混合物，也可以是用药物免疫动物得来的多克隆抗体。多克隆抗体一般需要用药物或人的IgG进一步亲和纯化之后才能用。
ADA检测方法开发验证中有一个关键问题是临界值的确定。ADA检测是定性或半定量的方法，需要设定一个临界值用于判断某个ADA样本是阴性还是阳性。一般是根据至少50个空白基质的多次检测的数据用统计的方法估算临界值[11,12]。如果数据是正态分布，可以套用简化的公式来计算。但是，很多情况下数据的分布状态不是正态的，这样给剔除离群值和用数据建模带来很大的挑战，用非参数法估算出的临界值受离群值的干扰较大，不一定合适。这时就需要统计学家的帮助。另外，如果在方法学验证阶段用于估算临界值的健康人的ADA数据分布状态和临床试验入组病人的ADA数据分布状态不一样，还需要用给药前的临床ADA样本来评估是否需要重新确定新的临界值用于特定的临床研究样本分析。
免疫原性风险管控
因为病人产生免疫原性的不确定性，在临床设计上需要采取一些措施来降低风险[1]。首先，对病人入组要有一些限制。有过敏史或自身免疫疾病的病人入组要慎重。用过同类药物的病人要排除或加上一些限制条件。其次，如果药物是高风险的，要选择适当的给药途径，频率，剂量等等来降低免疫原性的发生率。适当选择采样点以便用到ADA的数据用来帮助监测或减小免疫原性引起的副作用。输液反应不一定能找到直接的证据关联到免疫原性，但确实有不少病人发生输液反应时是ADA阳性，所以在有些高风险药物的临床试验中在给下一个剂量的药物时会参考病人的免疫原性状况，以便做好应急处理。
免疫原性评估报告
免疫原性评估通常是生物药临床试验中的探索性目标之一，在临床试验报告中通常需要附加一个免疫原性评估的子报告。中外监管部门最新的指导原则都要求在药物上市申报（BLA/MAA）时递交免疫原性综述（放在CTD2.7.2.4或CTD5.3.5.3中），其内容包括：该药物特异的免疫原性风险评估及缓解措施，免疫原性检测策略，各种检测方法学的验证，相关临床试验的用药批次，采样计划，检测手段，获得的数据，以及免疫原性与PK，疗效和安全的相关性等等[13]。在免疫原性风险预测方面，需要探索的因素包括药物自身的结构和理化性质，该药物及同类药物在计算机模拟分析，体外实验和体内实验的结果，给药方式，病人及适应症等。免疫原性的数据包含ADA的发生率和强度，起始时间和持续时期，中和抗体和预存抗体的影响，是否和内源性分子或其他药物有交叉反应。考虑到ADA发生率受到方法的灵敏度、特异性、病人群体、采样时间等因素影响，因此在比较不同药物的ADA数据时，单纯地比较ADA发生率会导致对数据的误解，对于ADA而言，尤其重要的是评估ADA的影响是否有临床上的意义并相应地指导对疾病的临床管理[14,15]。
总结
以上提纲挈领地介绍了生物药免疫原性评估的大致内容和步骤。生物药研发企业最关心的是药物研发的什么阶段应该做免疫原性研究的哪些方面，怎么做，做到什么程度。这需要根据不同类型药物的情况作深入细致的分析探讨来制定检测策略。
业界和监管部门积累的单抗类药物案例较多，但目前比较热门的多抗类药物、抗体偶联药物、特殊剂型药物和细胞治疗药物等大多还在摸索中，安渡生物在免疫原性评估等方面拥有顶尖的团队和与监管部门丰富的沟通经验，可以在全球范围内提供服务。所有的沟通、评估和决定是基于策略的可行性、科学的严谨性和数据的可靠性，通过各方共同努力尽快让安全有效的药物上市，最终惠及病人。
参考文献
-
Food and Drug Administration. Guidance for Industry: Immunogenicity assessment for therapeutic protein products. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. 2014.
-
European Medicines Agency. Guideline on immunogenicity assessment of therapeutic proteins. European Medicines Agency. Rev 1 2017.
-
Food and Drug Administration. Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration.2019.
-
国家药监局药品审评中心《药物免疫原性研究技术指导原则》，2021年3月.
-
Gupta S , Indelicato S R , Jethwa V , et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics[J]. Journal of Immunological Methods, 2007, 321(1-2):1-18.
-
Li J , Yang C , Xia Y , et al. Thrombocytopenia caused by the development of antibodies to thrombopoietin[J]. Blood, 2001, 98(12):3241-3248.
-
Casadevall N, Nataf J, Viron B, et al. Pure red-cell aplasia and antierythropoietin antibodies in patients treated with recombinant erythropoietin. N Engl J Med. 2002;346(7):469-475
-
Tourdot S, Hickling T P. Nonclinical immunogenicity risk assessment of therapeutic proteins[J]. Bioanalysis, 2019, 11(17):1631-1643.
-
Sue, Townsend, Brian, et al. Augmented Binary Substitution: Single-pass CDR germ-lining and stabilization of therapeutic antibodies.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015.
-
Yogurtcu O N , Sauna Z E , Mcgill J R , et al. TCPRO: An In-Silico Risk Assessment Tool for Biotherapeutic Protein Immunogenicity[J]. Biophysical Journal, 2019, 116(3).
-
Shankar G , Devanarayan V , Amaravadi L , et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2008, 48(5):1267-1281.
-
Devanarayan V , Smith W C , Brunelle R L , et al. Recommendations for Systematic Statistical Computation of Immunogenicity Cut Points[J]. AAPS Journal, 2017, 19(5).
-
Passey C , Suryawanshi S , Sanghavi K , et al. Reporting, Visualization, and Modeling of Immunogenicity Data to Assess Its Impact on Pharmacokinetics, Efficacy, and Safety of Monoclonal Antibodies[J]. AAPS Journal, 2018, 20(2):35.
-
Shankar G , Arkin S , Cocea L , et al. Assessment and reporting of the clinical immunogenicity of therapeutic proteins and peptides-harmonized terminology and tactical recommendations.[J]. AAPSJournal, 2014, 16(4):658-673.
-
Rup B , Pallardy M , Sikkema D , et al. Standardizing terms, definitions and concepts for describing and interpreting unwanted immunogenicity of biopharmaceuticals: recommendations of the Innovative Medicines Initiative ABIRISK consortium[J]. Clinical & Experimental Immunology, 2015, 181.