安渡视点 | 一文看懂体外细胞因子释放检测

免疫调节类药物在炎症、自免疫、异体移植和肿瘤治疗上都是十分成功的治疗性药物。然而，它们的高生物学活性可能伴随着严重且长效的系统性细胞因子释放，也被称为“细胞因子风暴”。

免疫调节类药物在炎症、自免疫、异体移植和肿瘤治疗上都是十分成功的治疗性药物。然而，它们的高生物学活性可能伴随着严重且长效的系统性细胞因子释放，也被称为“细胞因子风暴”。细胞因子风暴和细胞因子释放综合征是危及生命的全身性炎症综合征，涉及循环系统内细胞因子水平升高和免疫细胞过度活化，其触发原因可以是治疗、病原体、癌症、自身免疫病和单基因病。

产生细胞因子风暴最经典的单抗是OKT3，其靶点为T细胞抗原受体（TCR）复合物的CD3链。OKT3能够诱导高水平的TNF-α，IFN-γ与IL-2, 三者皆为关键的促炎性细胞因子，会导致毛细血管渗漏，白细胞隔离，流感样症状以及许多其他症状。在OKT3的案例中，T细胞显然是细胞因子释放的来源；而其他治疗性抗体，比如CAMPATH-1或利妥昔单抗本身不具备激活T细胞的能力，却仍能在临床上导致一定的细胞因子释放，这可能是通过将Fc-受体与其他细胞因子分泌细胞（例如NK细胞）相互连接而造成细胞因子的释放。在TGN-1412诱导细胞因子风暴引发健康受试者多器官衰竭的经验之后4，对于此类临床事件的理解有了很大的发展。为了通过实验来预测细胞因子释放，从而支持first in-human （FIH）研究，许多研究者对体外细胞因子释放测定（CRA）的不同实验类型进行了探讨5,6,7,8。

2021年03月29日CDE颁布的《药物免疫原性研究技术指导原则》中也提到：对于免疫调节类药物，完整的非临床评价需要整合所有可用的体内和体外试验数据，明确指出细胞因子的检测项目应优先考虑与受试药物细胞因子释放的预期机制类似者，并且与受试药物临床安全性考虑密切相关。

CRA的应用和目的

目前，CRA主要用于危害辨识，不能够支持风险的定量（例如有效的体外浓度与FIH剂量的相互转换）。在一些情况下，CRA用于在研发过程中为相同靶点的数个单克隆抗体的潜在风险排序。此外，CRA可以为人体中的细胞因子释放提供一些数据来解释其潜在机制。这能够帮助我们了解潜在的风险和缓解策略。

是否应用CRA的评价标准是产品与免疫系统产生交互的特性，例如佐剂，免疫调节剂和某些单克隆抗体。靶向膜结合抗原或受体的产品比靶向可溶性分子的产品可能具有较高的诱导细胞因子释放的能力。其他因素，比如脱靶效应，药物作用机制（比如抗体依赖细胞介导的细胞毒性ADCC，补体依赖的细胞毒性CDC），Fc亲和力以及特异性等需要在设计和实施CRA时纳入考虑。T细胞介导的反应可能更容易被预测，而其他机制例如Fc介导的效应（ADCC等）可能较难预测。

Assay Format选择

有多种CRA方法可供选择，从简单的测试系统到复杂的模型（例如共培养），或者其他尽可能模拟体内环境的系统。为了研究药物是否会刺激非预期的细胞因子分泌，可能需要来源于多种不同检测方法的数据。与TGN1412具有类似作用机制的产品的细胞因子释放能力可以通过固相方法测量5,6。然而，因为每个分子都有其自身的作用原理，CRA需要根据产品作用机制灵活调整来获得具有可比性和可信的结果。有多种实验方法可用，但目前的研究仍不足以根据不同类型的靶点和机制推荐特定的实验方法。决定最佳实验方法时需要考虑每种方法的优点和缺点。对于单克隆抗体，实验方法可以包含抗体溶解于溶液中，直接干包被于固定于培养板中，或通过anti-Fc非直接捕获。

比较经典的Format如下：

J Immunol 1 September 2007; 179 (5): 3325–3331

采用人全血或人外周血单个核细胞体外评价细胞活化和细胞因子的释放，可在一定程度上弥补因种属差异导致的动物模型无法模拟人体免疫激发过程的缺陷。然而，当细胞抗原或靶点是患者特有的，则患者应作为细胞来源，但从患者获取细胞目前是十分困难的。未来也可能由各种患者主导的组织提供帮助以获得细胞。

循环血单个核细胞（PBMC）通常比全血提供更充分的细胞因子释放。但是PBMC并不总是比全血更加合适，因为其可能缺少了某些重要因素，例如补体。有些研究使用共培养的方法，例如PBMC与内皮细胞，或与一些模拟胸腺环境的修饰后的细胞。

通常IL-2，IFN-γ，TNF-α，IL-6等是最可能造成损害的细胞因子。其他合适的细胞因子需要根据产品的作用机制进行选择。为了获得足够的信息，数据需用绝对值和倍数变化来表示。检测方法需要经过验证或者确认。选择合适的阳性和阴性对照在检测中非常重要，阳性对照为已知的导致临床细胞因子释放的抗体，阴性对照一般是未刺激的，同时还需要增加同型对照。

CRA数据的解释

目前的检测中，因无法确定需要引起注意的细胞因子释放的阈值导致不能对临床试验做出准确的安全风险提示。CRA被用来分辨能够产生严重的细胞因子释放（细胞因子风暴）的产品，[DC1] 并找出产生温和细胞因子释放的产品。在数据解读时，使用已知阳性或阴性抗体的实验能够进一步说明不同类型CRA的性能，同时在产品评估安全风险时，需要结合靶点表达的位置，表达量，药物作用机制，以及受体占有率进行解读，解释实验结果也需要考虑可获取的毒理-药理学数据。根据测试系统的可信度以及与产品作用机制的关联性，CRA的结果（阳性或阴性）有助于选择首次剂量与剂量爬坡实验的设计。由于细胞因子释放综合征的临床复杂性，将体外CRA结果外推至人体需要非常谨慎。

阳性CRA结果可能导致的风险

目前的共识中阳性的CRA结果不应该导致产品研发的停止。基于近年来一些上市药物（例如OKT3，抗胸腺免疫球蛋白，阿伦珠单抗anti CD52, 利妥昔单抗anti CD20）导致的细胞因子释放风险的管理的成功经验，创新药物的细胞因子释放情况也是可控制的。减轻细胞因子释放可以通过不同的给药途径（比如静脉注射改为皮下注射），输液的速度（缓慢输液与快速注射），以及受试者预治疗（例如使用皮质醇）。需注意肿瘤裂解综合征是一种由肿瘤细胞被化学药物杀死后引起的代谢综合征，能够导致高钾血症、高磷血症、低钙血症、尿毒症和急性肾功能衰竭，其症状与细胞因子释放不同。

安渡案例：通过多因子分析方法在超敏电化学发光检测平台（MSD）检测OKT3固相刺激hPBMC培养上清中的细胞因子水平，OKT3表现出明显的细胞因子释放。图A是通过MSD检测多因子的标准曲线，灵敏度高，定量范围广，且所需的样本体积较小，能够在较短的时间内获得更多可靠数据。图B是检测OKT3固相刺激hPBMC培养上清中的细胞因子水平，多个细胞因子均表现出比较强的刺激。

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参考文献

1. Goldman M, Abramowicz D, De Pauw L, et al. OKT3-induced cytokine release attenuation by high-dose methylprednisolone. Lancet. 1989; 2(8666):802-803
2. RO¨ MER et al. Preculture of PBMCs at high cell density increases sensitivity of T-cell responses, revealing cytokine release by CD28 superagonist TGN1412.Blood; 2011;118(26):6772-6782
3. In vitro cytokine release assays for predicting cytokine release syndrome: The current state-of-the-science. Report of a European Medicines Agency Workshop.Cytokine, 2010; 51 (2010) 213–215
4. Expert group on phase one clinical trials: final report (Chairman: Professor Gordon Duff); 7 December 2006.
5. Stebbings R, Findlay L, Edwards C, Eastwood D, Bird C, North D, et al. ‘‘Cytokine storm” in the phase I trial of monoclonal antibody TGN1412: better understanding the causes to improve preclinical testing of immunotherapeutics. J Immunol 2007;179(5):3325–31.
6. Findlay L, Eastwood D, Stebbings R, Sharp G, Mistry Y, Ball C, et al. Improved in vitro methods to predict the in vivo toxicity in man of therapeutic monoclonal antibodies including TGN1412. J Immunol Methods 2010;352(1–2):1–12.
7. Christine Grimaldi, et al. Cytokine release: A workshop proceedings on the state-of-the-science, current challenges and future directions. Cytokine 85 (2016) 101–108.
8. S. Vessillier, Cytokine release assays for the prediction of therapeutic mAb safety in first-in man trials — Whole blood cytokine release assays are poorly predictive for TGN1412 cytokine storm. Journal of Immunological Methods 424 (2015) 43–52.
9. Sandrine Vessillier, Development of the first reference antibody panel for qualification and validation of cytokine release assay platforms – Report of an international collaborative study. Cytokine: X 2 (2020) 100042.

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